Estrutura atômica de um vírus intacto é decifrada pela primeira vez com um laser de raios-X

O método experimental inovador acelerará substancialmente a análise proteica.  EurekAlert / Public Release Uma equipe internacional de cientistas utilizou pela primeira vez um laser de elétron livre de raios-X para desvendar em nível atômico a estrutura...

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O método experimental inovador acelerará substancialmente a análise proteica.

 EurekAlert / Public Release

Uma equipe internacional de cientistas utilizou pela primeira vez um laser de elétron livre de raios-X para desvendar em nível atômico a estrutura de uma partícula de vírus intacta. O método utilizado reduz drasticamente a quantidade de material de vírus necessário e, ao mesmo tempo, permite que pesquisas sejam realizadas várias vezes mais rápidas do que antes. Isso abre oportunidades de pesquisa inteiramente novas, informa a equipe de pesquisa liderada pelo cientista do DESY (sigla para Deutsches Elektronen-Synchrotron, Acelerador Síncrotron Alemão, o maior instituto de pesquisa em física avançada na Europa depois do CERN), Alke Meents,  no periódico Nature Methods.

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No campo conhecido como biologia estrutural, os cientistas examinam a estrutura tridimensional de moléculas biológicas para descobrir como elas funcionam. Este conhecimento aumenta a nossa compreensão dos processos biológicos fundamentais que ocorrem dentro dos organismos, como a forma como as substâncias são transportadas dentro e fora de uma célula, e também pode ser usadas para desenvolver novos medicamentos.

Estrutura superficial do enterovírus bovino 2. Suas três proteínas são codificadas na imagem em três cores. (Crédito: Jingshan Ren, Universidade de Oxford
Estrutura superficial do enterovírus bovino 2. Suas três proteínas são codificadas na imagem em três cores. (Créditos: Jingshan Ren, Diamond Light Source/Universidade de Oxford, Philip Roedig, DESY/CFEL/Universidade de Hamburgo, Sociedade Alemã Max Planck)

 “Conhecer a estrutura tridimensional de uma molécula como uma proteína dá uma ótima visão sobre seu comportamento biológico”, explica o co-autor David Stuart, Diretor do Life Sciences no laboratório do acelerador síncrotron Diamond Light Source no Reino Unido e professor da Universidade de Oxford. “Um exemplo é como entender a estrutura de uma proteína que um vírus usa para ‘se prender’ a uma célula pode significar que podemos projetar uma defesa para a célula para tornar o vírus incapaz de atacá-la”.

A cristalografia de raios-X é, de longe, a ferramenta mais prolífica utilizada pelos biólogos estruturais e já revelou as estruturas de milhares de moléculas biológicas. Pequenos cristais da proteína de interesse são cultivados e depois iluminados usando raios-X de alta energia. Os cristais difratam os raios-X em formas características para que os padrões de difração resultantes possam ser utilizados para deduzir a estrutura espacial do cristal — e, portanto, a de seus componentes — na escala atômica. No entanto, os cristais de proteínas não chegam a ser tão estáveis e resistentes como os cristais de sal, por exemplo. Eles são difíceis de aumentarem de tamanho durante o cultivo, muitas vezes ficando pequenos, e são facilmente danificados pelos raios-X.

Para o melhor de nosso conhecimento, esta é a primeira vez que a estrutura atômica de uma partícula de vírus intacta foi determinada usando um laser de raios-X”Alke Meents, Center for Free-Electron Laser Science (CFEL), Hamburgo, Alemanha

“Os lasers de raios-X abriram um novo caminho para a cristalografia de proteínas, porque seus pulsos extremamente intensos podem ser usados para analisar cristais extremamente pequenos que não produzem uma imagem de difração suficientemente brilhante usando outras fontes de raios-X”, acrescenta o co-autor Armin Wagner do Diamond Light Source. Contudo, cada um desses microcristais só pode produzir uma única imagem de difração antes de se evaporar como resultado do pulso de raios-X sobre eles. Para realizar a análise estrutural, portanto, centenas ou mesmo milhares de imagens de difração são necessárias. Assim, nesses experimentos, os cientistas fizeram um jato líquido fino de cristais de proteína ser injetado através de pulsos de laser de raio X, que libera uma sequência rápida de explosões extremamente curtas. Cada vez que um pulso de raios-X atinge um microcristal, é produzida e gravada uma imagem de difração.

Este método é muito bem sucedido e já foi usado para determinar a estrutura de mais de oitenta biomoléculas. No entanto, a maior parte do material da amostra é desperdiçado. “A taxa de sucesso é tipicamente inferior a dois por cento dos pulsos, de modo que a maioria dos preciosos microcristais acabam sem uso no recipiente de coleta”, diz Meents, que está sediado no Center for Free-Electron Laser Science (CFEL) em Hamburgo, um projeto de cooperação científica da DESY, da Universidade de Hamburgo e da Sociedade Alemã Max Planck. O método padrão, portanto, geralmente requer várias horas de tempo, de feixes e quantidades significativas de material de amostra.

Para usar o tempo de feixe limitado e o material de amostra precioso de forma mais eficiente, a equipe desenvolveu um novo método. Os cientistas usam um “chip” micropadronizado, uma micro-placa contendo milhares de poros minúsculos para reter os cristais de proteína. O laser de raios-X, então, o varre linha por linha e isso permite que uma imagem de difração seja registrada para cada pulso do laser.

Este é um esquema da configuração do experimento: o "chip" carregado com nanocristais é escaneado por raios-X (verde) poro por poro. Cada cristal produz um padrão de difração distintivo. Crédito: Philip Roedig, DESY
Este é um esquema da configuração do experimento: o “chip” carregado com nanocristais é escaneado por raios-X (verde) poro por poro. Cada cristal produz um padrão de difração distintivo. (Créditos: Philip Roedig et al., DESY)

A equipe de pesquisa testou seu método em duas amostras de vírus diferentes usando o laser de raios-X LCLS no SLAC National Accelerator Laboratory, nos Estados Unidos, que produz 120 pulsos por segundo. Eles carregaram o suporte da amostra com uma pequena quantidade de microcristais do enterovírus bovino 2 (BEV2), um vírus que pode causar abortos espontâneos, fetos natimortos e infertilidade no gado. Esse vírus também é muito difícil de ser cristalizado.

“Para o melhor de nosso conhecimento, esta é a primeira vez que a estrutura atômica de uma partícula de vírus intacta foi determinada usando um laser de raios-X”, afirma Meents. “Considerando que métodos anteriores em outras fontes de luz de raios-X requeriam cristais com um volume total de 3,5 nanolitros, conseguimos usar cristais que eram mais de dez vezes menores, com um volume total de apenas 0,23 nanolitros”.

Este experimento foi conduzido à temperatura ambiente. Enquanto o resfriamento os cristais de proteínas os protegeria até certo ponto dos danos causados pela radiação, isso geralmente não é viável quando se trabalha com cristais de vírus extremamente sensíveis. Os cristais de proteínas de vírus isolados podem, no entanto, ser congelados, e em um segundo teste, os pesquisadores estudaram a proteína viral poliedrina, que compõe um corpo de oclusão viral para milhares de partículas de vírus de certas espécies. As partículas de vírus usam esses recipientes proteicos para se proteger contra influências ambientais e, portanto, podem permanecer intactas por muito mais tempo.

Micrografia da placa ("chip") microestruturada carregado com cristais para a investigação. Cada quadrado é um cristal minúsculo. (Crédito: Philip Roedig, DESY)
Micrografia da placa (“chip”) microestruturada carregado com cristais para a investigação. Cada quadrado é um cristal minúsculo. (Créditos: Philip Roedig et al., DESY)

Para o segundo teste, os cientistas carregaram o chip com cristais de poliedrina e examinou-os usando o laser de raios X enquanto mantinha o chip a temperaturas inferiores a menos 180 graus Celsius. Aqui, os cientistas alcançaram uma taxa de sucesso de até 90 por cento. Em apenas dez minutos, eles haviam gravado imagens de difracção mais do que suficientes para determinar a estrutura da proteína dentro de 0,24 nanômetros. “Para a estrutura do poliedro, nós só precisamos escanear um único chip que foi carregado com quatro microgramas de cristais de proteína, que é uma ordem de magnitude inferior à quantidade que seria normalmente necessária”, explica Meents.

“Nossa abordagem não só reduz o tempo de coleta de dados e a quantidade da amostra necessária, mas também abre a oportunidade de analisar vírus inteiros usando laser de raio X”, resume Meents. Os cientistas agora querem aumentar a capacidade de seu chip em um fator de dez, de 22.500 para cerca de 200.000 microporos, e aumentar ainda mais a velocidade de varredura para até mil amostras por segundo. Isto exploraria melhor o potencial do novo XFEL europeu de elétron de raio X, que está entrando em operação na região de Hamburgo e que poderá produzir até 27.000 pulsos por segundo. Além disso, a próxima geração de chips só irá expor esses microporos que estão sendo analisados atualmente, para evitar que os cristais restantes sejam danificados por radiação dispersa do laser de raios-X.

Pesquisadores da Universidade de Oxford, da Universidade da Finlândia Oriental, do Instituto Suíço Paul Scherrer, do Laboratório Nacional Lawrence Berkeley nos EUA e SLAC também estiveram envolvidos na pesquisa. Os cientistas do Diamond colaboraram com a equipe da DESY, com grande parte do desenvolvimento e do chip teste micromodelado feito nas Linhas de Luz Síncroton  I02 e I24 da Diamond.

Sobre a Diamond Light Source

Laboratório de luz síncrotron Diamond Light Source, na Inglaterra. (Crédito: Diamond Light Source)
Laboratório de luz síncrotron Diamond Light Source, na Inglaterra. (Crédito: Diamond Light Source)

Diamond Light Source é o laboratório de ciência síncrotron do Reino Unido e é aproximadamente do tamanho do Estádio de Wembley. Funciona como um microscópio gigante, aproveitando o poder dos elétrons para produzir luz brilhante que os cientistas podem usar para estudar qualquer coisa, desde fósseis, motores a jato até vírus e vacinas. O Diamond é uma das instalações científicas mais avançadas do mundo, e suas capacidades pioneiras ajudam a manter o Reino Unido na vanguarda da pesquisa científica. 2017 marca uma dupla celebração pela Diamond – 15 anos desde a formação da empresa e 10 anos de pesquisa e inovação. Neste momento, os pesquisadores que obtiveram seus dados na Diamond criaram mais de 5.000 artigos científicos.

Sobre o DESY

Deutsches Elektronen-Synchrotron—DESY é um dos principais centros de aceleração de partículas do mundo. Os pesquisadores usam as instalações de grande escala na DESY para explorar o microcosmo em toda sua variedade — variando da interação de pequenas partículas elementares ao comportamento de nanomateriais inovadores e biomoléculas aos mistérios fundamentais do universo. Os aceleradores e detectores que o DESY desenvolve e constrói em suas localidades em Hamburgo e Zeuthen são ferramentas únicas para a ciência e a pesquisa. A DESY é membro da Helmholtz Association, a maior organização científica da Alemanha, e recebe o seu financiamento do Ministério Federal da Educação e Pesquisa (BMBF) (90 por cento) e dos estados federais alemães de Hamburgo e Brandeburgo (10 por cento).

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Referências:

  1. ROEDIG, Philip et al. High-speed fixed-target serial virus crystallography; Nature Methods, 2017; DOI: 10.1038/nmeth.4335;
  2. First atomic structure of an intact virus deciphered with an X-ray laser. EurekAlert/AAAS. Acesso em 10 de julho de 2017;

  3. DESY. First atomic structure of an intact virus deciphered with an X-ray laser. Acesso em 10 de julho de 2017.

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